研究内容の紹介

生体機能を理解する上で、顕微鏡は極めて強力なツールです。特に電子顕微鏡は、最近の革新的な装置開発によって、タンパク質の3次元原子構造の決定や、細胞・組織の高分解観察のツールとして大きく飛躍しています。我々は、この進展著しい親水環境での電顕観察法をさらに発展させ、氷の中で様々に向いたタンパク粒子を撮影し3次元構造を計算する単粒子構造解析と、水環境で細胞・組織の微細構造をそのまま観察できる大気圧電子顕微鏡(ASEM)による細胞内複合体の構造と機能研究を行っています。

1.  電子顕微鏡( 電顕) 単粒子解析法を開発することによって、神経細胞膜チャネル・受容体など生理機能に重要なタンパク質の構造を解析し、脳の柔軟さを制御する分子機構の研究を行っています。最近の成果では、脳活動などに重要な様々の膜タンパク質の3次元構造を決定しました。世界的な潮流となってきている極低温電顕による単粒子構造解析法の開発に長年取り組み、個々のタンパク質粒子を撮影し情報学的に解析することで、電圧感受性Naチャネル[Fig:1]、TRPC3・ORAIチャネルやIP3受容体[Fig:2]、アルツハイマーの原因β-amyloid を生産するγ–secretase、老化や癌防止に重要な酸化ストレスセンサーKeap1の構Na channel造を世界に先駆け決定しました。

Fig. 1 極低温電子顕微鏡と解明された電圧感受性Naチャネル構造。3次元構造計算には、脳の情報処理を模したNeural Networkなどの最新の情報学を用いる
( nature 2001)。

 

Ip3Fig. 2 IP3受容体チャネル (左; JMB 2004)と老化を防ぐ酸化ストレスセンサーKeap1(右; PNAS 2010)の構造

 

 

 

2.  さらに、細胞内でこれらタンパク質の複合体形成やその働く機構を理解するために、水中で細胞を直接高分解能観察できる大気圧走査電顕(ASEM) を開発しました。これにより、微小シナプスやその内部も観察できるようになり、タンパク質の神経細胞内での複合体形成や機能の解明を行っています。両方法を組み合わせ、分子と細胞・組織をつなぐ総合的な理解、特に神経機能の理解を目指しています[Fig:3]。

ASEM_sy_ti

Fig. 3 水中の細胞が直接見られる大気圧電子顕微鏡ASEMを日本電子と共同開発(左; JSB 2012)、微小な結線によるシナプス群を観察(中)、正常な脊髄(右:第1カラムの2枚)と白矢印の癌細胞が転移した脊髄(右: 第2カラムの2枚 ; IJO 2015)


水中が見える大気圧走査電子顕微鏡ASEMによる
マイコプラズマ迅速観察法の開発

マイコプラズマは肺炎や様々な病気の原因である。現在大流行中のマイコプラズマ肺炎は、特に早期診断法が求められている。しかし、マイコプラズマ感染症は早期診断が難しい。それは、この菌が光の波長よりも小さく、光学顕微鏡(光顕)では観察・認識が難しいからである。電子顕微鏡はより詳細な構造が観察できるが、真空中で撮影する必要がある。真空に耐える前処理に時間がかかり、早期診断には間に合わない。電子顕微鏡と半導体製造技術の融合により産総研と日本電子が共同開発した大気圧走査電子顕微鏡は、水環境中でのマイコプラズマの直接観察を可能にする。本観察法は、マイコプラズマの迅速診断への道を拓くのみならず、今マイコプラズマ対策として求められているその増殖や感染機構の解明など基礎研究に広く活用できる。
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酸化ストレスセンサー(Keap1)の
電顕単粒子解析


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大気圧走査型電子顕微鏡(ASEM)の開発

溶液中で細胞を観察できる大気圧走査型電子顕微鏡(ASEM)を日本電子との共同研究により開発した。精製さえできれば単粒子解析法が可能であるが、不安定な超分子複合体は、精製すら受け付けないことも多い。そのような複合体を細胞中で観察するため、電子顕微鏡と半導体製造超薄膜技術の融合により、体の組織や細胞を乾燥させずに、固定するだけで液中で直接観察できる走査電子顕微鏡を開発した。そこでは、薄膜で真空と細胞とを隔離することで、8nmの高分解能観察を達成し、更に蛍光光学顕微鏡での同視野相関観察を実現している。

この大気圧に保持した試料を観察できる倒立型の走査電子顕微鏡ASEMは、電子線を透過する耐圧薄膜SiNを備えたディッシュを用いる。従来必要であった試料を真空中で撮影する為の前処理(数時間~数日以上に及ぶ脱水・乾燥等)は不要となり、これに伴う試料の変形・変性の恐れも回避できる。また薄膜上方に光学顕微鏡も配置しており、蛍光染色による細胞内ダイナミクスの観察と固定後にSEMによる高分解能観察が可能になる。ディッシュは開放系であり、細胞の初代培養も可能で薬を作用させたり、ウイルス感染させた後で固定し、高分解能観察することができる。

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Na チャネル

sodium channel

電子線単粒子解析法はタンパク質の様々な向きの電子顕微鏡像から3次元構造を再構築することにより、その3次元構造を決定する。元々はウイルス粒子、リボゾーム等の比較的大きなたんぱく質に関して行われてきた方法である。しかし、近年その適用できる下限は徐々に下がり、100kDa程度のより小さな膜たんぱく質の解析も可能になってきた。同時に、その分解能も高くなり、4Å以上にまで達している。read more...

Keap1

keap1 thumbnail

酸化ストレスは、食品やミトコンドリアから漏れ出る親電性物質等によって引き起こされ、DNA損傷による発癌・老化などを引き起こす。それを防止する酸化ストレスセンサーであるKeap1は、酸化ストレスを感知して転写因子NRF2との結合・分解を止めることで、NRF2の核への移行を促し、解毒酵素群を誘導する。単体でも結晶を形成しないが、DCドメインのみだと結晶を形成する。そこから、X線により解析された構造はβ-プロペラであった。

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Orai1

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イオンチャネルは、神経などの興奮細胞でのイオン流入の研究により発見された。しかし、非興奮細胞でも情報伝達に重要なイオンチャネルが存在する。特に、免疫機構に必須なOrai1はSOCであり、本研究ではその精製に成功し、さらにその構造を突き止めた。細胞質側に突起を持ち、小胞内Caイオンセンサー・STIMと直接結合すると思われる。

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TRPC3

TRPc3 thumbnail

我々は音や味覚を始め、様々な刺激に応じて細胞膜でCaイオンを透過させて、細胞内へと刺激を伝えている。そこで主役として活躍するのがセンサーを持つチャネルであるTRP channel群である。 これらは、情報伝達物質と結合し、分子内にイオン通路を開いてCaイオンを流入し、細胞内部へと情報を伝達する。

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IP3R

Orai1 thumbnail

IP3受容体は神経細胞内の小胞膜に存在するイオンチャンネルである。その役割は小胞内に存在するCaイオンの放出を制御することである。我々の細胞内ではCaイオン濃度は通常、厳密に低い濃度に抑えられており、この小胞から放出されるCaイオンは細胞の様々な活動を制御し、その影響は我々の高次機能にも及んでいる。そのため、IP3受容体チャンネルは生体の活動にとって重要である。さらには、神経可塑性にも重要な役割を果たすことも示唆されている。このチャンネルは、その細胞質側にIP3とCaの両方が結合すると、開いてCaを通す。しかしその構造とそれに基づく開閉機構は、明らかにされていなかった。

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TRPM2

TRPM2 thumbnail

TRPチャネル中でも、特に温度や酸化ストレスのセンサーであるTRPM2は注目されている。このチャネルを精製・負染色電顕撮影・単粒子画像解析を行った。その結果、TRPC3と似た隙間だらけの膨れあがったベル型2重入れ子構造を持つことを解明した。

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γ-セクレターゼ
SPP

SPP Thumbnail

SPPは、シグナルペプチド(SP)を切断する膜タンパク質です。膜タンパク質や分泌タンパク質には、SPを持った分子が多く存在し、これらタンパク質を生産するときにSPの切断・除去は不可欠です。SPPのアミノ酸配列は、アルツハイマー症の原因となるβ-amyloidを生産するγセクレターゼの活性中心サブユニットPresenilinと似ており、膜内配列切断酵素ファミリーに属します。また、SPPはC型肝炎ウイルスやマラリアの増殖などに関わることが知られており、創薬標的タンパク質として期待されます。

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MG23

MG23 thumbnail

今回は分子量23kDaの3回膜貫通たんぱく質Mg23の機能が、陽イオン透過であることを見つけた。その構造を電子顕微鏡像から再構成したところ、主な構造はおよそ36量体からなるボール(深皿)状であることを決定した。

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M. Mobile  マイコプラズマ (ASEM)

mobile cut

マイコプラズマは肺炎やリューマチ様々な病気の原因である。現在大流行中のマイコプラズマ肺炎は、特に早期診断法が求められている。しかし、マイコプラズマ感染症は早期診断が難しい。それは、この菌が大腸菌の1/25の体積であり、光の波長よりも小さく、光学顕微鏡(光顕)では観察・認識が難しいからである。水中を見れる大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)により、水環境中でのマイコプラズマの迅速な詳細観察と免疫電顕を可能にした。

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現象の動的観察 (ASEM)

ASEM dishes

従来型電子顕微鏡では試料を真空中で観察するために、水溶液中の観察は無理であった。この限界を破り、水溶液を解放空間中で観察できる大気圧電子顕微鏡(ASEM)で物性分野での動的な観察を行った。分解能は8nmである。蒸発による塩の結晶化と電気分解における電極への金属の析出を観察した。また、ハンダの融解・凝固における2つの金属相の分布がダイナミックに変化する様子を観察し、最後に、MIP-1αタンパク質をアルデヒドで200nmの球状粒子にしたものが、粒子が細密充填構造的に規則正しく積み重なっていく様子がビデオ撮影できた。自己組織化が観察できたと言える。

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癌術中診断への応用の可能性 (ASEM)
細胞が水中で観察できる大気圧電子顕微鏡ASEMを開発してきた。サンプルホルダーは上部が解放されたdish構造であり、その底のSiN薄膜越しに反射電子を観察する。切り出した組織ブロックを化学固定後にPTAなどで染色し、薄膜上におき水中で観察した。組織表面2-3μmの深さが自然な水環境中で観察できた。

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タンパク質構造決定技術、膜タンパク質精製技術、情報技術、電子顕微鏡技術、神経細胞の培養技術等.