Na channel reconstructionKeap1

酸化ストレスは、食品やミトコンドリアから漏れ出る親電性物質等によって引き起こされ、DNA損傷による発癌・老化などを引き起こす。それを防止する酸化ストレスセンサーであるKeap1は、酸化ストレスを感知して転写因子NRF2との結合・分解を止めることで、NRF2の核への移行を促し、解毒酵素群を誘導する。単体でも結晶を形成しないが、DCドメインのみだと結晶を形成する。そこから、X線により解析された構造はβ-プロペラであった。我々はKeap1全タンパク構造を解明するために、我々は東北大 山本雅之研究室との共同研究により、全タンパク質の精製に成功し、負染色して電顕撮影し、さらに単粒子解析を行った。この2量体タンパク質は全体としてサクランボ状の形をしていた。その2つの房にはそれぞれ中心に小さな穴が上下に貫通していた。これが、X線構造解析で解明されたDCドメインβ-プロペラの数Å径の穴に一致する。このことから、サクランボの実がそれぞれDCドメインに相当することがわかる。さらにその周囲を取り囲んでいるサクランボの実の膨らみ部分に、酸化ストレスを感知するSH基が存在して中のDCを制御することも推察された。


Abstract from: Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jan 27

 

Keap1 is a forked-stem dimer structure with two large spheres enclosing the intervening, double glycine repeat, and C-terminal domains.

Ogura T, Tong KI, Mio K, Maruyama Y, Kurokawa H, Sato C, Yamamoto M.

Neuroscience Research Institute and Biological Information Research Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1-4 Umezono, Tsukuba 305-8568, Japan.

Keap1 is a substrate adaptor of a Cullin 3-based E3 ubiquitin ligase complex that recognizes Nrf2, and also acts as a cellular sensor for xenobiotics and oxidative stresses. Nrf2 is a transcriptional factor regulating the expression of cytoprotective enzyme genes in response to such stresses. Under unstressed conditions Keap1 binds Nrf2 and results in rapid degradation of Nrf2 through the proteasome pathway. In contrast, upon exposure to oxidative and electrophilic stress, reactive cysteine residues in intervening region (IVR) and Broad complex, Tramtrack, and Bric-à-Brac domains of Keap1 are modified by electrophiles. This modification prevents Nrf2 from rapid degradation and induces Nrf2 activity by repression of Keap1. Here we report the structure of mouse Keap1 homodimer by single particle electron microscopy. Three-dimensional reconstruction at 24-Å resolution revealed two large spheres attached by short linker arms to the sides of a small forked-stem structure, resembling a cherry-bob. Each sphere has a tunnel corresponding to the central hole of the beta-propeller domain, as determined by x-ray crystallography. The IVR domain appears to surround the core of the beta-propeller domain. The unexpected proximity of IVR to the beta-propeller domain suggests that any distortions generated during modification of reactive cysteine residues in the IVR domain may send a derepression signal to the beta-propeller domain and thereby stabilize Nrf2. This study thus provides a structural basis for the two-site binding and hinge-latch model of stress sensing by the Nrf2-Keap1 system.

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タンパク質構造決定技術、膜タンパク質精製技術、情報技術、電子顕微鏡技術、神経細胞の培養技術等.